Das ergab die Auslosung auf dem Norisring in Nürnberg. Als "Glücksfee" fungierte dabei die WM-Botschafterin und ehemalige Nationalspielerin Renate Lingor, auch Bundestorwarttrainer Andreas Köpke war bei der Auslosung dabei. Die erste Hauptrunde findet zwischen dem 31. Juli und dem 3. August 2009 statt.

Lingor und Köpke zogen noch weitere spannende Duelle: Titelverteidiger Werder Bremen muss zum Auftakt beim Zweitliga-Aufsteiger 1. FC Union Berlin ran, der Deutsche Meister VfL Wolfsburg reist zum Drittligisten SV Wehen Wiesbaden. Bayer Leverkusen, im Vorjahr noch im Finale in Berlin, muss zum SV Babelsberg reisen. Besondere Brisanz verspricht auch das traditionsreiche Derby zwischen Kickers Offenbach und dem großen Rivalen Eintracht Frankfurt.

Die 32 Spiele der ersten Hauptrunde im Überblick:

Dynamo Dresden - 1. FC Nürnberg

Rot-Weiß Erfurt - MSV Duisburg

SG Sonnenhof Großaspach - VfB Stuttgart

SC Paderborn - 1860 München

SpVgg Weiden - Borussia Dortmund

VfL Osnabrück - Hansa Rostock

SV Babelsberg - Bayer 04 Leverkusen

TSV Germania Windeck - Schalke 04

Eintracht Trier - Hannover 96

1. FC Magdeburg - Energie Cottbus

VfB Lübeck - Mainz 05

SpVgg Elversberg - SC Freiburg

FC Ingolstadt - FC Augsburg

FSV Frankfurt - Borussia Mönchengladbach

SpVgg Neckarelz - FC Bayern München

1. FC Union Berlin - Werder Bremen

Kickers Offenbach - Eintracht Frankfurt

FC Oberneuland - 1899 Hoffenheim

FC 08 Villingen - FC St. Pauli

SpVgg Unterhaching - Arminia Bielefeld

Eintracht Braunschweig - 1. FC Kaiserslautern

SV Wehen Wiesbaden - VfL Wolfsburg

SC Concordia Hamburg - TuS Koblenz

Wormatia Worms - SpVgg Greuther Fürth

TeBe Berlin - Karlsruher SC

Wacker Burghausen - Rot-Weiss Ahlen

Sportfreunde Lotte - VfL Bochum

Kickers Emden - 1. FC Köln

Preußen Münster - Hertha BSC Berlin

Fortuna Düsseldorf - Hamburger SV

VfB Speldorf - Rot-Weiß Oberhausen

Torgelower SV Greif - Alemannia Aachen